Induktion av b-galaktosidasaktivitet hos E-coli

Förberedelse, Uppodling av förkultur:          Bakterier E coli (lac +)          Sterilt minimal-medium          Sterilt rör, 10 ml          Steril plastplatinös          Vattenbad/värmeskåp 37 grader En förkultur startas genom att 5 ml sterilt odlingsmedium ympas med bakterier från en E coli stam med inducerbar b-galaktosidasgen (lac +). Låt röret stå i vattenbad 37 grader,  1 dygn.
Laboration Dag 1, eftermiddag: Ympning med E coli för uppodling över natt. Varje labgrupp ympar 30 ml sterilt minimal-medium med 2 ml förkultur (se förberedelser). Röret ställs därefter i vattenbad 37 grader till nästa dag.
Dag 2. Kontroll av tillväxten Alternativ 1: Titta på lösningen mot ljuset. Det ska skimra av bakterier i lösningen. Alternativ 2:  Mät absorbansen vid 550 nm hos bakterielösningen. Den bör vara 0,3 - 0,5.
Induktion Märk 20 st eppendorfrör (1,5 ml) med vattenfast penna. Tillsätt 2 droppar toluen till varje eppendorfrör. Ställ rören på isbad	A0 A10 A20 A30 B0 B10 B20 B30 C0 C10 C20 C30 D0 D10 D20 D30 E0 E10 E20 E30
Märk 5 provrör (10-15 ml) med A, B, C, D, resp E. Till rören A, B, C, D, och E sätter man de lösningar och volymer, som står i tabellen till höger.	Lösning rör A B C D E vatten (ml) 200 150 50 150 50 laktos 0,1 mol/l (ml) 50 50 50* glukos 0,1 mol/l (ml) 100 IPTG 0,1 mol/l (ml) 50 kloramfenikol (ml) 100
	*alternativ: man kan ta 50 ml IPTG i stället för laktos
Sätt sedan 5 ml av E coli-lösningen till varje rör..
Tag omedelbart med pipett 1 ml prov från rör A till eppendorfrör A0, 1 ml prov från rör B till   eppendorfrör B0 etc (= nollprov) Skaka eppendorfrören och ställ tillbaka dem i isbadet.
Ställ sedan provrören så snabbt som möjligt i vattenbadet.
Starta tidtagningen!
Efter 10, 20 resp 30 min tas 1 ml prover på motsvarande sätt som ovan. Använd aotomatpipett och byt spets för varje provtagning. Eppendorfrören ska stå i is tills alla prover är tagna.
Därefter placeras eppendorfrören i vattenbadet (37 grader) under 30 minuter.
Aktivitetsmätning
Till varje eppendorfrör (A0 t o m E30 sätter man 100 µl ONPG.
Ställ omedelbart rören tillbaka i vattenbadet. Rören ska stå i vattenbadet exakt 5 minuter.
Avbryt genast reaktionen genom att tillsätta 250 µl natriumkarbonatlösning.
Resultat
Lägg eppendorfrören mot en vit bakgrund och studera färgintensiteten. Vilka slutsatser kan du dra?