© Biokomp i Göteborg AB                         

ã biokomp
Klicka här  för e-post till webmaster om frågor kring laborationen

PCR, Polymerase Chain Reaction, av DNA från l-fagen

Målgrupp  

 

 

  

Experimentet är lämpligt i gymnasiet och kan göras i grupp eller som specialarbete.   

Introduktion    Mångfaldiga en speciell del av en DNA-molekyl (PCR) kräver att reaktionsblandningen innehåller
  • nukleotider för uppbyggnad av DNA,
  • enzymet Taq-DNA-polymeras för att koppla ihop nukleotiderna
  • lämplig reaktionsmiljö bland annat med avseende på pH och konc av Mg2+.
  • l-DNA, det DNA där fragment ska mångfaldigas (amplifieras)
  • DNA-primers (primer-par, korta DNA-strängar 20-25 baspar) som ska vara startbitar i den DNA-sträng, som amplifieras
  • för att kunna bestämma storleken av det amplifierade fragmentet använder man en lämplig stege, storleksmarkör när man analyserar resultatet från PCR-reaktionen i agarosgel.
 

 

Figur 1

  

För lambda ampl.jpg (21499 bytes)
PRC-reaktionen  

 

PCR-reaktionen är en cyklisk process. Fig.2


Betingelserna vid amplifieringen ska utformas på följande sätt:

  1. Strängarna i DNA-molekylen frigörs från varandra (denatureringtemperatur 94-95oC)

  2. Primrarna ska fästa till rätt ställe på DNA
    (annealingtemperatur här 52oC)

  3. Primrarna förlängs när nukleotider komplementära mot mallsträngen hakas på med hjälp av enzymet Taq-DNA-polymeras (elongeringtemperatur 720C)

 

Säkerhet
Laborationen innehåller ett moment med hantering av lösning innehållande etidiumbromid (EtBr), som är mutagen.
cross.jpg (2225 bytes)
Engångshandskar används som personligt skydd.

Skyddspapper bör användas på bänkytor där EtBr-lösning hanteras.
Kärl, som har innehållit utspädda lösningar av EtBr får rengöras under rinnande vatten.
Handskar, skyddspapper och annat engångsmaterial, som varit i kontakt med EtBr läggs i en plastpåse, som försluts och läggs bland sopor som går till förbränning.
EtBr sönderfaller vid förbränningen till ofarliga produkter.
Observera!

Vid arbete med DNA måste man vara försiktig, så att inte lösningarna kontamineras med enzymet DNas som bryter ner DNA. Använd handskar och vidrör aldrig pipettspetsar, rör med stamlösningar av DNA eller enzymlösningar direkt med händerna. (DNas finns på våra händer)

 
 

Material

  
  • PCR-apparat
  • eppendorfcentrifug
  • automatpipett  1 -10 ml
  • stoppade spetsar

 
 

Kemikalier

  
  • Ready-To-Go PCR Beads är små kulor, som innehåller alla nödvändiga reagens utom primers och DNA-mall för att utföra en PCR-reaktion i volymen 25 ml. (= PCR-mix). Kulorna är stabila i rumstemperatur och levereras i PCR-rör.
  • l-DNA
  • primers för amplifiering av bestämda fragment på l-DNA
    här L 160.1, L 160.2 och L500.1, L 500.2
 

Utförande

  

Programmera PCR-apparaten enligt skissen. Om programmet redan finns inlagt kontrollerar du att det överensstämmer med schemat.

 
Figur 2 PCRdiagram.jpg (19433 bytes)

 


Amplifiering av två olika långa fragment på l-DNA, ett 160 baspar och ett annat 500 baspar.

PCR160_500.jpg (27775 bytes)
Figur 3
Amplifiering av ett fragment på 160 baspar Amplifiering av ett fragment på 500 baspar
  • Märk ditt PCR-rör: "160" + signatur
  • Tillsätt 19 ml sterilt avjonat vatten till innehållet i PCR-röret
  • Märk ditt PCR-rör: "500" + signatur
  • Tillsätt 19 ml sterilt avjonat vatten till innehållet i PCR-röret
  • Tillsätt 2 ml av varedera primern L160.1 resp L160.2 till PCR-röret. Sätt lösningarna som små droppar på rörets insida. (Använd helst automatpipett med stoppade spetsar.)
  • Tillsätt 2 ml av varedera primern L500.1 resp L500.2 till PCR-röret. Sätt lösningarna som små droppar på rörets insida. (Använd helst automatpipett med stoppade spetsar.)
  • Tillsätt 2 ml l-DNA. Sätt även detta som en droppe på rörets insida.
  • Tillsätt 2 ml l -DNA. Sätt även detta som en droppe på rörets insida.
  • PCR-reaktionen bör startas så snart som möjligt efter det att alla reagens har blandats, låt därför dropparna sitta kvar på rörets insida tills alla i gruppen är klara med pipetteringarna.
  • När alla är klara centrifugeras samtliga PCR-rör några sekunder och därefter sätts de i PCR-apparaten. Programmet startas.
  • När PCR-reaktionen är klar innehåller programmet som sista steg att rören står vid temperaturen 8oC. Härifrån flyttas rören för korttidsförvaring till kylskåp och för längre förvaring i –20oC. Analysen av PCR-reaktionen på agarosgel ( Figur 5) kan alltså göras vid ett senare tillfälle.

 

 

Elektroforetisk analys  i agarosgel av de aplifierade DNA-fragmenten

Gjutning av gel till submarin gelelektrofores

 

Kemikalier
Agaros för separation av nukleinsyra
TBE-buffert: stamlösning (27g Tris+13,5g borsyra+2,3g EDTA i 0,5 l vatten)
späds 10 ggr före användande

Utförande
Späd stamlösningen av TBE-buffert 10 ggr. Tänk på att göra så mycket att det räcker till gelgjutning och till elektroforeskärlet.

För gelformar utan speciell gjutform: Tejpa gelformens kortsidor med tejp, gärna dokumenttejp. Gör gärna ett litet "öra" att dra i för att underlätta borttagandet av tejpen.

Lägg gelformen på ett absolut vågrätt underlag.

  • Väg upp agaros till 1,5% agaroslösning i en 200 ml E-kolv.
  • Tillsätt brukslösning TBE-buffert, markera vätskenivån.
  • Värm lösningen i mikrovågsugn tills den är alldeles glasklar.
  • Låt den svalna till ca 60oC, justera ev vätskenivån med avjonat vatten.
  • Häll gelen i gelformen till 4-5 mm höjd. Ta bort ev luftblåsor med pasteurpipett
  • Sätt ner en eller två kammar för provbrunnsformning, innan agarosen stelnat.
  • När agarosen stelnat (efter ca 15-20 min), tas tejpen bort och gelformen läggs i elektroforesapparaten.
  • Ta bort kammen eller kammarna försiktigt.
  • Elektroforesbuffert hälls på så mycket att den står 1-2 mm över gelytan.
 

elektrof.gif (8657 bytes)
Figur 4. Submarin elektrofores

 

Kontroll av amplifiering:

Kemikalier
BFB-lösning: Lös 50 mg bromfenolblått i 20 ml 50%-ig glycerol.
Proverna behöver innehålla en tung vätska för att sjunka ner i brunnen genom buffertskiktet. Färgämnet (även det negativt laddat), ska visa att DNA-proverna vandrar i rätt riktning, men ger också information om hur snabbt vandringen sker.

Brunnarna i gelen rymmer 10 - 20 ml, beroende på kammens tänder och gelens tjocklek.
Laddning av
proverna i gelen
(förslag)
  • sätt på olika mängd amplifierat DNA från de två fragmenten
  • sätt även på en lämplig storleksmarkör ("stege") i detta fall med band mellan 100 och 1000 bp för att kunna bedöma storleken av amplifierat DNA.
    Se bilden nedan!
 

pcr-gel ny.jpg (36778 bytes)

Figur 5
       OBS!
      Handskar!

 

Synliggörande av DNA i gelen med etidiumbromid

Både gel och elektroforesbuffert används utan etidiumbromid.

  • Efter avslutad elektrofores läggs gelen i en plastlåda med brukslösning av TBE-buffert innehållande etidiumbromid. Lämplig koncentration av etidiumbromid i framkallningsbad är 0,5 mg/ml.
  • Gelen får ligga där 10-20 min.
  • Skölj av gelen genom att föra över den till ett bad med avjonat vatten 1 min.
  • Flytta över gelen till en plastpåse med "blixtlåsförslutning". DNA-banden framträder vid UV-belysning av gelen.

Plastpåsen minskar obetydligt detektionsgraden, men skyddar effektivt laboranten från att komma i beröring med den etidiumbromidinnehållande gelen
Dekontaminering
av etidiumbromid		 Etidiumbromidinnehållande lösningar behandlas på följande sätt:
  • Tillsätt ca 100 mg aktivt kol/100 ml lösning.
  • Låt lösningen stå minst 1 h i rumstemperatur. Skaka om den då och då.
  • Filtrera lösningen genom ett filterpapper.
  • Häll bort filtratet, som nu är fritt från etidiumbromid.
  • Lägg filtret med aktivt kol i en plastpåse och knyt ihop. Låt påsen gå till avfall för förbränning.

Etidiumbromid sönderfaller vid 262oC, dvs vid förbränning, till ofarliga föreningar
Resultat

 

 

 

Figur 6

PCR_resultat.jpg (10886 bytes)

  

 

 

 

Tydligt framträder de amplifierade banden,
ett vid 500 bp och ett annat  något under 200 bp.

Jämfört med DNA-banden i stegen är mängden DNA i fragmenten större, vilket gör dessa band bredare.

 

 

Alternativ infärgning (med lägre känslighet)
Synliggörande av DNA i gelen med metylenblått
 
  • Efter elektrofores läggs gelen i en plastlåda med 0,025% metylenblåttlösning 20-30 min.
  • Skölj gelen försiktigt under rinnande vatten och fortsätt avfärgningen tills banden framträder.
  • Titta på gelen på overheadapparat eller annat ljusbord.

Fördelen med denna metod är att man slipper hantera den mutagena etidiumbromiden.