© Biokomp i Göteborg AB

Bakterier E coli RR1 innehållande plasmid
Kit för plasmidpreparation
Sterilt rör, 10 ml (gärna graderat)
Steril plast-platinös, för engångsbruk eller platinös (platinaögla)
Vattenbad eller värmeskåp 37 ^o C Eppendorf-centrifug.

• Tillsätt 20 m l ampicillinlösning till ett sterilt rör innehållande 5 - 6 ml LB-medium

• Ympa denna lösning med en renstruken bakteriekultur av E coli RR1 innehållande

pUC - plasmid. Låt bakterierna växa i termostaterat vattenbad, 37oC, över natten.

• Fyll ett eppendorfrör med bakteriesuspension. Centrifugera ner bakterierna vid 4000 rpm, 1 min. Häll av supernatanten. Tillsätt ytterligare en omgång bakteriesuspension i samma rör, centrifugera och häll av noga. Upprepa ännu en gång.

• Slamma noga upp bakterie-pelleten i 250 µl lyseringsbuffert. (P1 med tillsatt RNas). Nu luckras cellmembranet upp

• Tillsätt 250 µl buffert P2 till de lyserade bakterierna. Blanda mycket försiktigt genom att vända röret upp och ner 2 gånger. Skaka inte, eftersom det kan medföra att DNA går sönder i mindre bitar.

• Skaka inte ty det kan medföra att DNA går sönder i mindre bitar. Suspensionen ska bli klarare och viskös. Låt inte reaktionen pågå längre än 5 min

• Tillsätt 350 µl buffert N3 och blanda genast genom att vända röret upp och ned 3-4 gånger. (Bufferten är basisk med hög saltkoncentration. Nu bildas en flockig fällning av proteiner, högmolekylärt RNA och kromosomalt DNA)

• Centrifugera 10 min vid 10 000 g. Nu bildas en kompakt pellet.
• Placera en "QIAprep kolonn" i ett 2 ml uppsamlingsrör

• Häll den klara supernatanten i kolonnen. (Denna lösning innehåller plasmiden, som fastnar på kolonnmassan.)

• Centrifugera 30-60 sek. Släng eluatet.

• Tvätta plasmiden genom att hälla 500 µl buffert PB på kolonnen och sedan centrifugera 30-60 sek. Släng eluatet. Detta steg avlägsnar spår av nukleasaktivitet från plasmidpreparationen när vissa stammar med hög nukleasaktivitet eller högt kolhydratinnehåll används.

• Tvätta kolonnen med buffert PE genom att hälla 750µl PE i kolonnen.Centrifugera 30-60 sek. Släng eluatet. Centrifugera ytterligare 1 minut för att få bort rester av vätska i kolonnen.

• Märk ett 1,5 ml eppendorfrör.

• Placera QIAprep kolonnen i röret.

• Tillsätt 60 µl elueringsbuffert, buffert EB. OBS! Pipettera ner dropparna i centrum av kolonnens kiselskiva. Låt stå 1 minut!

• Centrifugera 10 000 g 1 minut. I eppendorfröret finns nu lösningen innehållande pUC-plasmiden. Röret innehållande plasmiden kan sparas i kylskåp +4^oC eller långtidsförvaras i frys –20^oC.

Elektroforetisk analys görs i agarosgel. Sätt 6 resp 12 µl plasmidlösning på gelen

Kitet kan beställas från VWR (Kebo Undervisning).
Bakterier beställes från Biokomp i Göteborg AB, Skolvägen 15, 42835 Kållered
tel 031 7952979   fax 994670