Zonelektrofores

Material Vattenkyld elektroforesapparatur kopplad till likriktare .
Färdiggjutna gelplattor
Provappliceringsremsa
Filtrerpapper
Allduk
Wettexduk
Lösningar Buffertlösning: 0,2M Tris-HCl,  pH 8,6 (24,2 g  Tris löses i ca 750 ml vatten. Tillsätt 38 ml 2 M HCl och späd till 1 l med vatten).
Bromfenolblåttlösning:50 mg bromfenolblått löst i 50 ml Trisbuffert.(Bör förvaras i kylskåp)
Fixeringslösning: Innehåller 12,5% triklorättiksyra och 3,5 % sulfosalicylsyra
Avfärgningsvätska: Blanda 350 ml etanol,100 ml ättiksyra och 550 ml vatten 
Färglösning: 1 g amidosvart löst i avfärgningsvätska
Utförande

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fyll på buffertlösning i elektrodkärlen. Det är viktigt att vätskenivån blir lika i båda kärlen.
Tag fram den färdiggjutna gelen. Var försiktig så att gelen inte skadas.
Häll några ml vatten på kylplattan och lägg på gelplattan.
Anslut gelen till buffertkärlen med hjälp av en med buffert väl genomfuktad wettexduk. Duken förankras med plaststavar och en täckande glasskiva.
Stäng locket och sätt likspänningsaggregatet på 150 V. Kontrollera att det går ström igenom. Stäng av strömmen igen och öppna locket.

Placera försiktigt den smala filtrerpappersremsan på gelen parallellt med och ca 3 cm från den långsida, som ligger vid katoden. Låt remsan ligga på gelen ca 30 sek och lyft sedan försiktigt bort den.
Där filtrerpappersremsan har legat lägger man nu applikationsmasken för provpåsättning och trycker mycket försiktigt fast masken mot gelytan.

Fyll med hjälp av kapillärrör eller automatpipett skårorna i applikationsmasken med olika lösningar av blodproteiner 3-5µl. En albuminlösning färgad med bromfenolblått är lämpligt att sätta på så att man kan se hur proteinet vandrar.

Låt proverna diffundera in i gelen under ca 5 minuter. Tag försiktigt bort masken och lägg den i en bägare med vatten.
Stäng locket. Koppla på spänningen och vrid upp till 150 V. Kontrollera att polerna är rätt kopplade, så att proteinerna vandrar mot mitten av plattan. Öka till 250 V efter 5 min. OBS! Spänningen får inte öka så mycket att strömstyrkan överstiger 250 mA.
Elektroforesen får pågå tills det skarpa bromfenolblåfärgade bandet har vandrat ungefär 5 cm. Då bryts strömmen och plattorna tas upp.
Fixering Plattorna läggs i fixervätska i 10 min. Därefter tas de försiktigt upp så att inte gelskiktet lossar från plattan. Ett filtrerpapper genomfuktat med vatten läggs på gelytan. Ovanpå detta lägger man ett ca 1 cm tjockt skikt av allduk eller hushållspapper. Lägg överst en tjock glasskiva och sätt ovanpå denna en tyngd på ca ½ kg. Låt detta ligga i ca 5 minuter. Upprepa proceduren en eller två gånger med ny allduk. Det är mycket viktigt att all gelvätska sugs upp i detta moment.

Ta sedan FÖRSIKTIGT bort filtrerpapperet (lossa ett hörn först, så att gelen stannar kvar på plattan). Torka med hårtork tills plattan är helt torr och glasklar, annars blir det en mycket kraftig infärgning av bakgrunden.
Färgning Färgning (kan göras samma dag eller vid ett senare tillfälle) Låt plattorna ligga i färglösningen i 10 min. Skölj därefter i tvättvätska tills bakgrunden är helt avfärgad. Torka plattan med hårtork.

Kopiera eller rita av de färgade banden.
Återanvändning Den använda tvättvätskan filtreras genom aktivt kol (ej granulerat) på dubbla filtrerpapper (sugfiltrering) och hälls tillbaka i flaskan.

OBS! Kolet ska efter användandet slängas i plastpåse, inte direkt i papperskorg.