Bild med engelsk text
Syftet med experimentet är att klyva linjär DNA och en plasmid samt att ligera
fragmenten varvid man får plasmid, som innehåller delar från det linjära
DNA´t.Utgångsmaterial för experimentet är DNA från bakteriofag l,
ett välkarakteriserat dubbelsträngat DNA på ca 50 kb, och DNA från plasmiden pUC, som
bland annat innehåller en gen för ampicillinresistens och en gen för enzymet b-galaktosidas.
Både l-DNA:t och plasmiden klyvs med samma restriktionsenzym,
t ex Eco RI. Enzymet klyver l-DNA:t i 6 fragment av
kända storlekar och med klistriga ändar.
pUC-plasmiden klyvs på endast ett ställe, så att den öppnas upp till en linjär
plasmid, även den med klistriga ändar.
Man använder elektrofores på agarosgel för att kontrollera om klyvningen lyckats.
Små DNA-fragment vandrar snabbare än stora i gelen. Man får alltså en separation efter
storlek.
l-DNA-fragmenten och den linjära plasmiden blandas
och enzymet DNA-ligas tillsätts.
Vid ligeringen kommer fria DNA-ändar att
bindas ihop i olika kombinationer. Vissa plasmider kommer att ringslutas igen, andra
kommer att binda ett l-DNA-fragment och sedan ringslutas. l-DNA-fragment kan också återförenas eller ringslutas. Man kontrollerar resultatet av ligeringen med elektrofores. |